Х-сцепленная умственная отсталость (X-linked intellectual disability) представляет собой клинически и генетически гетерогенную группу наследственных заболеваний, обусловленных мутациями, локализованными на хромосоме Х и приводящими к нарушению интеллектуального развития. Суммарная частота данных заболеваний в популяции варьирует от 1:1000 до 1,8:1000 [1, 2]. Проблема Х-сцепленной умственной отсталости чрезвычайно актуальна не только из-за ее высокой распространенности, но и в связи с тем, что она сопровождается тяжелым поражением нервной системы и ведет к глубокой инвалидности.

С клинических позиций Х-сцепленную умственную отсталость принято разделять на синдромальную и несиндромальную (неспецифическую) [3]. При синдромальных формах при клиническом осмотре ребенка, лабораторных и функциональных исследованиях обнаруживают различные аномалии, помимо нарушений интеллекта. Больные с синдромальными формами могут иметь нарушения физического развития, пороки развития мозга и других органов, комплекс микроаномалий, неврологические симптомы, особенности поведения, метаболические расстройства. При несиндромальных формах Х-сцепленной умственной отсталости эти признаки отсутствуют и наблюдается изолированная умственная отсталость [4]. Следует отметить, что деление на синдромальные и несиндромальные формы патологии не является специфичным только для Х-сцепленной умственной отсталости, а используется и в отношении ее аутосомных форм.

До сих пор существуют трудности диагностики Х-сцепленной умственной отсталости среди недифференцированных нарушений интеллекта, не определена этиология многих заболеваний данной группы, недостаточно изучена роль инактивации хромосомы Х в формировании клинического полиморфизма Х-сцепленной умственной отсталости, а также асимптоматического носительства мутаций Х-сцепленных генов, что затрудняет проведение медико-генетического консультирования и определение генетического риска возникновения повторных случаев патологии. В связи с вышеизложенным целью настоящего исследования была разработка системы ранней эффективной диагностики Х-сцепленных форм умственной отсталости на основе молекулярно-генетического, эпигенетического (исследование инактивации хромосомы Х) и молекулярно-цитогенетического анализа клинического полиморфизма различных форм патологии.

Характеристика детей и методы исследования

В основу работы положено комплексное клинико-генетическое обследование 703 детей в возрасте от 3 мес до 18 лет с Х-сцепленной умственной отсталостью, выявленных среди 10749 больных с недифференцированными формами нарушений интеллекта. Наблюдались дети с моногенными Х-сцепленными синдромами, проявляющимися преимущественно у гетерозиготных девочек, такими как синдромы Ретта, Блоха–Сульцбергера, Айкарди, Гольтца и др. (n=441), моногенными Х-сцепленными заболеваниями, проявляющимися преимущественно у гемизиготных мальчиков — синдромами ломкой хромосомы Х (FRAXA), Хантера, Коффина–Лоури, Опица–Каведжиа, Симпсона–Голаби–Бемеля и др. (n=208). Кроме того, обследованы 36 больных со структурными микроаномалиями хромосомы Х и 18 детей с несиндромальными формами Х-сцепленной умственной отсталости.

Использовались клинико-генеалогический, функциональные, цитогенетический, молекулярноцитогенетические и молекулярно-генетические методы. Для повышения эффективности клинической диагностики в ходе исследования разработаны системы количественной оценки тяжести течения наиболее частых Х-сцепленных форм умственной отсталости — синдромов ломкой хромосомы Х и Ретта. Данные системы представляли собой ранговые шкалы, разработанные на основании анализа фенотипа больных с указанными заболеваниями, и включали оценку психологического и неврологического статусов, комплекса микроаномалий, признаков поражения соединительной ткани, а также антропометрических показателей (всего 25 признаков для синдрома Ретта и 23 признака для синдрома ломкой хромосомы Х). Шкалы построены таким образом, что учитывают не только наличие, но и экспрессивность каждого признака, оценка которой включает число градаций от 0 до 5 баллов. Для оценки тяжести состояния ребенка проводилось суммирование количества баллов, соответствующих каждому из симптомов. Разработанные шкалы использовались нами с целью исследования клинического полиморфизма заболеваний и зависимости фенотипических признаков от генотипа больных.

Молекулярно-генетические, цитогенетический и молекулярно-цитогенетические методы были разработаны и осуществлялись в лабораториях молекулярной цитогенетики нервно-психических заболеваний НИКИ педиатрии и цитогенетики и геномики психических заболеваний Научного центра психического здоровья РАМН [5]. Определение мутаций гена МЕСР2 проводилось с помощью прямого автоматического секвенирования. При анализе числа CGGповторов в промоторе гена FMR1 использовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим капиллярным электрофорезом в полиакриламидном геле. Анализ особенностей инактивации хромосомы Х был основан на метилчувствительной рестрикции фланкирующих последовательностей экспансии тринуклеотидных (CAG)n -повторов интрона 1 гена андрогенового рецептора (AR) с последующим количественным ПЦР-анализом. При анализе метафазных хромосом, полученных из культивированных лимфоцитов периферической крови, применялись методы G- и С-окрашивания. Для проведения серийной сравнительной геномной гибридизации (серийной CGH) использовался наночип Constitutional Chip® 4.0 фирмы Perkin Elmer, который позволяет сканировать геном с разрешением 0,5–1 млн парнуклеотидов (пн) и имеет более 600 ВАС проб на хромосому Х [6].

Применялись стандартные методы статистической обработки: программа данных SPSS (Statistical Package for Social Sciences), включающая стандартные методы для медико-биологических исследований.

Результаты и обсуждение

Оценка удельного веса Х-сцепленной умственной отсталости Среди 10 749 детей с нарушениями интеллекта, наблюдавшихся в клиниках Научно-исследовательского клинического института педиатрии, выявлены 703 (6,54%) ребенка с Х-сцепленными заболеваниями. Удельный вес наиболее частых форм Х-сцепленной умственной отсталости составил для синдрома Ретта 4,28% среди девочек, а для синдрома умственной отсталости, сцепленной с ломкой хромосомой Х, — 4,16% среди мальчиков. Высокий удельный вес Х-сцепленной умственной отсталости и наиболее часто встречающихся ее форм определяет актуальность исследований данной патологии. Согласно данным литературы, удельный вес Х-сцепленных форм умственной отсталости оценивается как 10–12% [7]. Причина более низкой (выявленной нами по сравнению с ожидаемой) частотой патологии заключается в сложности идентификации случаев несиндромальных форм, нераспознаваемых клиническими методами. Удельный вес 6,54% в большей степени отражает частоту синдромальных форм Х-сцепленной умственной отсталости, нежели патологии в целом. Следовательно, значительная часть случаев Х-сцепленной умственной отсталости остается в группе недифференцированных форм. В связи с этим представляется особо значимым поиск лабораторных диагностических маркеров, общих для данной группы заболеваний, и разработка диагностического алгоритма для Х-сцепленной умственной отсталости.

Генеалогические исследования в семьях с Х-сцепленной умственной отсталостью

Проведен анализ 595 родословных детей с Х-сцепленной умственной отсталостью, включавших сведения о 19789 индивидуумах (табл. 1). Генеалогическое исследование имело наибольшее значение в семьях больных с несиндромальными формами патологии (n=18), поскольку Х-сцепленный характер наследования нарушений интеллекта служил единственным критерием, согласно которому в этих семьях была идентифицирована Х-сцепленная умственная отсталость.

Таблица 1. Результаты генеалогического анализа в семьях с X-сцепленной умственной отсталостью (n=595)

Как видно из табл. 1, генеалогический анализ малоинформативен в диагностике Х-сцепленных синдромов, проявляющихся преимущественно у гетерозигот: только в одной из 354 семей с синдромом Ретта и одной из 13 семей с синдромом Блоха–Сульцбергера заболевание встречалось более чем у одного индивидуума, а в остальных было спорадическим. В то же время генеалогический анализ сыграл значимую роль в диагностике синдромальных форм X-сцепленной умственной отсталости, проявляющихся преимущественно у гемизигот: в 35 (17%) из 208 проанализированных родословных заболевание наблюдалось более чем у одного мальчика, т.е. получены доказательства сцепленного с полом наследования заболевания (синдромы ломкой хромосомы Х, Опица–Каведжиа, Менкеса, Аарскога и др.).

Молекулярно-генетические, молекулярно-цитогенетические исследования и анализ корреляций генотип/фенотип при X-сцепленной умственной отсталости

У 114 детей мужского пола, отобранных из группы больных с недифференцированной умственной отсталостью при использовании шкалы количественной оценки клинических признаков синдрома ломкой хромосомы Х (более 50 баллов), исследовалось количество CGG-повторов в гене FMR1 (рис. 1, а). Экспансия тринуклеотидных повторов была обнаружена в 46 (40%) из 114 случаев, что в более чем 10 раз превышает процент подтверждения этого диагноза в зарубежных генетических центрах (2–3,8%) [8]. Полученные данные указывают на эффективность отбора больных с помощью количественной клинической шкалы. У родственников пациентов по материнской линии мутации и премутации гена FMR1 были выявлены в 43 (84%) из 107 случаев (рис. 1, б). У этих родственников были обнаружены заболевания, ассоциированные с премутацией гена FMR1, — раннее наступление менопаузы у женщин и синдром тремора и атаксии у мужчин. Поскольку эти индивидуумы имеют высокий риск рождения детей с умственной отсталостью, то их выявление представляется исключительно важным.

Рис. 1. Анализ количества тринуклеотидных повторов в промоторе гена FMR1 методом ПЦР с последующим капиллярным электрофорезом. На электрофореграммах продуктов ПЦР определено: а – ~232 CGG-повтора (полная мутация гена FMR1) у ребенка с синдромом FRAXA; б – 80 CGG-повторов (премутация гена FMR1) у матери ребенка с синдромом умственной отсталости, сцепленной с ломкой хромосомой Х.

Суммарная оценка тяжести фенотипа по клинической шкале и оценка экспрессивности отдельных признаков (зрительный контакт, ускоренный темп речи, комплекс лицевых микроаномалий, макроорхизм, аномалии соединительной ткани и увеличение окружности головы) у детей с синдромом ломкой хромосомы Х была статистически достоверно выше, чем у больных с недифференцированными формами умственной отсталости (критерий Манна–Уитни, p<0,001). Клинические признаки, по которым эти дети статистически достоверно отличались, можно считать наиболее специфичными для заболевания и использовать для его выявления среди недифференцированных форм умственной отсталости. У гетерозиготных по полной мутации девочек степень нарушений интеллекта широко варьировала.

У детей с синдромом Ретта мутации гена MECP2 были обнаружены в 315 (91%) из 354 случаев, что является одним из самых высоких среди опубликованных в литературе показателей эффективности клинической диагностики заболевания и, по-видимому, служит результатом строгого отбора детей с помощью разработанной клинической шкалы. Рекуррентные мутации были определены у 201 (64%) ребенка, наиболее частой была мутация R255X, найденная у 50 (16%) детей, в том числе у пары конкордантных по синдрому Ретта близнецов. Вторая наблюдавшаяся нами пара конкордантных близнецов имела мутацию R270X, частота которой в наблюдавшейся когорте детей с мутациями составила 11%. Частоты других рекуррентных мутаций: 3% для R106W, 7% для R133C, 14% для T158M, 11% для R168X, 3% для R294X и 8% для R306C. Большинство детей с мутациями в гене MECP2 были женского пола, за исключением двух мальчиков с классическим течением заболевания, у которых определен соматический мозаицизм по мутациям R168X и R270X. У одного из мальчиков (с мутацией R270X) наблюдался тканеспецифический мозаицизм по анеуплоидии хромосомы Х, обнаруженной в 14% ядер мышечных клеток (кариотип — 47,XXY/46,ХY).

Среди детей с врожденной формой синдрома Ретта и формой с ранним началом судорог мутаций гена МЕСР2 не найдено. У 7 девочек с вариантом синдрома Ретта с ранним началом судорог обнаружены мутации гена CDKL5, что позволило установить диагноз атипичного синдрома Ретта.

Анализ влияния типа мутации в гене MECP2 на тяжесть течения заболевания показал, что суммарная оценка тяжести фенотипа в баллах у больных с нонсенс-мутациями и мутациями со сдвигом рамки считывания статистически достоверно выше, чем у детей с миссенс-мутациями (44,6 балла против 33,8 балла, t=4,031, p<0,001). Проведен анализ тяжести течения заболевания в зависимости от позиции мутации в гене MECP2 (рис. 2). Наибольшая тяжесть клинических проявлений наблюдалась у больных с мутациями, локализованными между 158 и 270 аминокислотными остатками белка MeCP2 (мутации R168X, R255X и R270X), а наименьшая тяжесть — у детей с мутациями R106W и R133C, а также с мутациями, расположенными ближе к 3’-концу гена (мутации R294X, R306C, делеции на 3’-конце). Таким образом, показана зависимость тяжести течения синдрома Ретта от типа и позиции мутации в гене МЕСР2, что важно для понимания генетических основ клинического полиморфизма заболевания и прогнозирования его течения.

Рис. 2. Оценка зависимости тяжести течения синдрома Ретта от позиции мутации.

У детей с синдромом Ретта (n=34), у которых молекулярно-генетическим методом мутации гена МЕСР2 не были установлены, проведено исследование с помощью технологии arrayCGH, в результате чего в 10 случаях выявлены микроделеции Xq28, захватывающие ген МЕСР2. Следовательно, впервые было показано возникновение синдрома Ретта в результате полной делеции данного гена [9].